中药材种子鉴定方法与研究进展,中药材种子DNA宏条形码鉴定流程

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摘要:种子是中药产业的源头,中药材种子的准确鉴定不仅关系到中药材的真伪,更关系到中药的安全性和有效性。不可能 多数中药材种子体积较小、内含物丰厚、内部结构内部结构易受种子性性成熟是什么是什么度和环境条件的影响,难以通过传统最好的方式进行有效鉴定。DNA条形码技术利用一段标准的DNA序列从基因层面对物种进行鉴定,不受环境等内部内部结构因素影响,具有通用、快速、准确等特点,逐渐成为中药材种子鉴定的研究热点。简述了DNA条形码技术在中药材种子鉴定中的研究现状,分析了中药材种子DNA条形码鉴定的技术要点,总结了不之类型中药材种子进行DNA条形码鉴定的原则,并提出了利用宏条形码技术鉴定市售混合中药材种子的研究最好的方式,为中药材种子鉴定提供新的研究思路。

近年来,随着《中医药发展战略规划纲要(2016—20100年)》《中华人民共和国中医药法》等文件法规的颁布实施,我国加大了对中医药产业的扶持力度。中药材是中医药传承和发展的物质基础,但野生资源破坏严重[1],当前主要依赖人工种植供应。同时全国也在大力推进中药材种植产业扶贫政策,中药材的种植规模不断扩大。中药材种子作为中药材种植的源头,趋于稳定种源混乱、种质混杂等疑问,质量参差不齐,鉴定错误的种子不仅会带来严重的经济损失,也会给临床用药带来极大的安全隐患。

传统中药鉴定最好的方式如基原鉴定、性状鉴定、显微鉴定、理化鉴定,其研究对象主要为基原植物、药材、饮片和联 成药,缺乏对中药材种子的系统研究。此外,种子作为药用植物的繁殖器官,多数质量较轻、内部结构简单、内含物丰厚,其内部结构内部结构易受种子性性成熟是什么是什么度和内部内部结构环境的影响,难以通过传统最好的方式进行鉴定。DNA条形码利用一段标准的DNA序列从基因层面对物种进行鉴定[2-3],不受植物生长环境、发育阶段、样品内部结构和组织部位的限制,弥补了传统中药鉴定最好的方式对于中药材种子鉴定的空缺,逐渐成为中药材种子鉴定的研究热点[4]。

1传统最好的方式在中药材种子鉴定中的局限性

传统的中药鉴定最好的方式如基原鉴定、性状鉴定和显微鉴定多利用中药的外观性状和显微内部结构进行鉴定。与传统中药学鉴定对象不同,中药材种子的内部结构内部结构、外观内部结构和显微内部结构易受环境和种子性性成熟是什么是什么度等因素影响,相同物种的种子往往趋于稳定内部结构差异[5]。理化鉴定多利用药材内含物的理化性质差异进行鉴定,而中药材种子是活的繁殖器官,其内含物会随着种子的性性成熟是什么是什么、储藏时间以及萌发而消耗,内含物的理化性质也会趋于稳定改变。不可能 中药材种子的特殊性,传统中药鉴定最好的方式仅都可以 对种子类中药材和次要中药材种子进行鉴定。

2 DNA条形码技术在中药材种子鉴定中的应用

DNA条形码技术利用基因组中一段标准的、相对较短的DNA片段进行物种鉴定[6]。2010年,陈士林等提出ITS2为药用植物的通用条形码,相关研究表明ITS2序列都可以 很好地鉴定伞形科[7]、芸香科[8]、蔷薇科[9]、豆科[10]、菊科[11]等多个科属的药用植物。在此基础上,陈士林等[12]建立了以ITS2为核心、psbA-trnH为补充序列的药用植物DNA条形码鉴定体系,广泛运用于中药鉴定的各个领域,并纳入《中国药典》2015年版四部[13],推动了中药鉴定学的“文艺复兴”[4]。相较于传统最好的方式,DNA条形码技术以物种的遗传信息为鉴定最好的方式,不受植物生长环境、发育阶段、样品内部结构和组织部位的限制,具有通用性、客观性、准确性等特点。

2.1中药材种子DNA条形码鉴定的研究现状

2014年,研究人员采用DNA条形码技术分别对种子类药材天仙子和车前子进行鉴定,但其目的是鉴定种子类药材及其混伪品,不须鉴定生产用途的种子[14-15]。2016年,刘金欣等[16]架构设计 19份中药材桔梗种子样品,基于ITS2序列对桔梗种子进行物种鉴定,结果表明ITS2序列都可以 准确鉴定桔梗种子。泽泻与东方泽泻内部结构极为之类,传统鉴定最好的方式难以分辨,张娜娜等[17]基于ITS2序列对56份泽泻种子的样品进行鉴定,结果表明有20份样品为泽泻,36份样品为东方泽泻。2018年,石林春等[18]架构设计 51份知母种子样品,对其ITS2和psbA-trnH序列进行测序,基于BLAST法、遗传距离法和邻接(NJ)系统发育树法进行物种鉴定,结果显示51份样品皆为正品。刘金欣等[19]通过构建黄芩ITS2条形码数据库,利用DNA条形码技术对62份市售黄芩种子样品进行鉴定,结果发现黄芩、甘肃黄芩和粘毛黄芩在NJ系统发育树上分别聚为独立的支,都可以 相互区分。100份市售黄芩种子样品为正品,2份趋于稳定真菌污染。此外,还有学者对种子或果实类中药材王不留行[20]、补骨脂[21]以及中药材种子北沙参[22]、羌活[23]、重楼[24]、丹参[25]、人参[26]等运用DNA条形码技术进行了鉴定,都取得了成功。

2.2不之类型中药材种子DNA条形码鉴定的原则

本课题组当前已架构设计 100余种中药材种子样品,发现中药材种子的大小趋于稳定较大差异(图1)。实验发现,微小中药材种子,若只取单粒种子进行实验,得到的DNA浓度极低,无法满足后续PCR扩增要求;体积较大的种子内含物中所含血块淀粉、蛋白质、脂肪,提取的DNA杂质多,质量较差;此外,另有次要异花授粉药用植物的种子,受精卵和受精极核不可能 趋于稳定不同的基因型,遗传物质简化,影响ITS2序列的测序质量。因此,不之类型的中药材种子前要采用不同的DNA条形码实验流程(图2)。之类,对于个体较大的种子或次要异花授粉药用植物的种子,不可能 种皮由珠被发育而来,种皮细胞中的DNA与母株相同,取中药材种子的种皮部位提取DNA都可以 外理异花传粉受精原困的杂交和因种子内含物丰厚原困提取的DNA杂质太满疑问。对于个体较小的中药材种子,取种子发芽后的组织进行实验,都可以 外理不可能 种子体积过小原困的DNA浓度低、质量差你这些 疑问。

3中药材种子宏条形码鉴定最好的方式

3.1宏条形码技术的研究进展

传统的DNA条形码技术主要用于单个样品的物种鉴定,随着下一代测序技术的发展,2012年,Taberlet等[27]提出了宏条形码技术的构想,即首先提取混合样品的DNA,扩增DNA条形码序列,因此使用下一代测序平台进行高通量测序,最后基于DNA条形码的研究策略进行混合样品的高通量鉴定。当前,宏条形码技术不可能 广泛运用于微生物群落、动植物多样性和联 成药处方成分鉴定等的研究[28-32]。Xin等[33]采用宏条形码和单分子实时测序(single molecule real timesequencing,SMRT)测序相结合的最好的方式,对中成药九味羌活丸进行了鉴定,结果表明,该最好的方式可重复、可靠、灵敏地检测九味羌活丸中原药材的基原。王丽丽[34]提取了人参健脾丸、人参归脾丸、蛇胆川贝胶囊、启脾丸4种所含名贵中药材的中成药DNA,对ITS2序列进行了PCR扩增,并利用高通量测序技术对PCR产物进行了测序,结果表明4种中成药中均所含正品中药材的近缘种。Xin等[35]利用宏条形码技术对市售龙胆泻肝丸进行了鉴定,发现其中所含木通的混伪品,而化学鉴定最好的方式必须对二者进行区分。石林春等[36]建立了如意金黄散原料药的数据库,并用宏条形码技术对如意金黄散中的原料药材进行鉴定,结果表明,该技术可检测到除厚朴外的全版处方成分,其中苍术药材掺杂了混伪品朝鲜苍术,天南星药材掺杂了混伪品虎掌南星,提示如意金黄散临床使用的有效性和安全性趋于稳定潜在风险。Valentini等[100]架构设计 了53种两栖类和86种鱼类使用特异性引物对其进行了宏条形码测序,实验结果表明,这两对引物成功地扩增样本中所有两栖类和鱼类的DNA,在淡水鱼种类中,81%鉴定到了种,14%鉴定到了属,5%鉴定到了科;在海洋鱼类中,有68%鉴定到种,32%鉴定到科。Arulandhu等[37]建立了所含1一一一两个多条形码序列的多重宏条形码技术,该技术都可以 识别出自制混合样品和市售中成药中大多数植物和动物种类,包括含量为1%的原料。

上述研究表明,宏条形码技术都可以 准确鉴定混合样品中的物种,进行多样性分析,这也使血块种子的物种构成和纯度分析成为不可能 ,为中药材种子质量评价提供新的技术手段。

3.2中药材种子宏条形码鉴定流程

基于宏条形码技术的研究策略,结合中药材种子自身的特点,本课题组提出中药材种子的宏条形码鉴定流程,即按照“五点取样法”获得每份种子的代表性样品,进行混合种子的总DNA提取,DNA提取可重复数次以保证提取到所有种子的DNA;为每份样品设计特异性序列标签(MID)并连接到引物的5’端以实现血块样品的同时检测,分别进行3次独立的PCR扩增,合并3次扩增产物,使用琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物,使用纯化试剂盒进行PCR产物纯化;Qubit精确测定浓度后,等量混合所有样品,使用下一代测序平台进行建库测序;利用质量控制软件进行测序质量检测,并去除低质量序列,根据MID区分并提取不同样品的序列,使用BLAST最好的方式或某些最好的方式与DNA条形码数据库进行比对,对每份种子样品的物种构成进行分析,最终建立基于宏条形码技术的中药材种子群体鉴定最好的方式(图2)。

4结语

当前,中药材种子市场比较混乱,其混乱的原困[38]主要有:①中药材品种繁多,各地用药习惯不统一,同物异名、同名异物药材十分常见。之类,益母草在江苏某地区称为天芝麻,浙江称三角胡麻,青海称千层塔等;《中国药典》规定狼毒为大戟科植物月腺大戟或狼毒大戟的干燥根,与瑞香科狼毒属植物狼毒同名,两者皆有毒性,极易混淆。②缺乏专业的中药材种子市场,中药材种子从业人员专业素质参差不齐。③行业管理和质量监督力量薄弱,中药材种子依照农作物种子管理,多数中药材种子缺乏国家质量标准。④缺乏系统的中药材种子鉴定最好的方式。

不可能 中药材种子自身的特点,利用传统最好的方式鉴定中药材种子具有一定局限性,DNA条形码鉴定技术为中药材种子鉴定提供了新的手段,具有诸多优点。DNA条形码技术依靠生物的遗传信息进行鉴定,都可以 外理不可能 中药材种子外观性状和内含物的变化给鉴定结果带来的失误[5-6]。同时,DNA条形码技术易于构建统一的DNA条形码序列数据库,不受环境的影响和经验的限制[39-40]。基于DNA水平的分子鉴定技术有望实现种子鉴定的标准化和自动化,能够中药材种子产业的守护线程化和规范化,将在中药材栽培前物种选择、种质资源库建设、中药材种子流通管理等领域发挥作用[41]。

传统的DNA条形码技术必须对单一物种进行鉴定,对于血块种子的群体鉴定和纯度分析趋于稳定困难。随着高通量测序技术的发展,使快速血块地获取样品遗传信息成为不可能 。宏条形码技术结合了DNA条形码技术和高通量测序技术的个人优点,都可以 对混合样本中所有物种的DNA片段进行同时检测,都可以 应用于在市售中药材种子的群体鉴定中。都可以 预见,这项技术不可能 给中药材种子鉴定技术的发展带来新的契机,将大大推进我国中药材种子鉴定规范化建设守护线程。

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